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La historia comienza dos años después del final de la película anteriorPeter Parker encuentra cada vez más difícil conciliar su lucha contra el crimen como Spider-Man y las demandas de su trabajo y su vida personal.2 3 Las relaciones con Mary Jane Watson, de la que está enamorado, y su mejor amigo Harry Osborn se resienten y este último alimenta un ansia de venganza contra Spider-Man por su papel en la muerte de Norman, el padre de Harry.3 4

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Harry, ahora jefe del departamento de investigación de Oscorp, patrocina los experimentos del brillante científico nuclear Otto Octavius. Octavius, cuyo sueño es perfeccionar la producción de energía de fusión, lleva un chaleco con brazos mecánicosinteligentes, resistentes al calor y al magnetismo durante un experimento que deviene inestable. El chip de inhibición neuronal que impide a los brazos robóticos influir en su mente es destruido durante el accidente y los tentáculos se fusionan con sucolumna vertebral.2 Cuando le trasladan a un hospital los tentáculos matan al personal médico y Otto, enloquecido, escapa, convertido en el Doctor Octopus o Doc Ock.3 4

Mary Jane se compromete con el astronauta John Jameson, hijo de J. Jonah Jameson,2 Peter sufre una crisis emocional y pierde el control de sus poderes, tras lo que decide renunciar a su identidad alternativa y vivir simplemente como Peter Parker.3 Cuando el crimen en Nueva York aumenta hasta niveles preocupantes, Peter decide hacer frente a sus demonios personales a raíz de una conversación con su tía May y encarnarse en Spider-Man de nuevo.

El Doctor Octopus precisa tritio para reactivar el reactor y acude a Harry. Este accede a darle todo el tritio que posee, con la condición de que capture a Spider-Man,2 y le revela que Peter es la clave para dar con él. Sin embargo, le ordena no causarle ningún mal a Peter. El Doctor Octopus localiza a Peter y secuestra a Mary Jane para atrapar a Spider-Man. Resuelto a rescatarla y dándose cuenta de que ha recobrado sus poderes, Peter recupera su traje y entra en batalla contra el Doctor Octopus en lo alto de una torre y sobre un tren fuera de control, que Spider-Man consigue detener antes de que se precipite al vacío al final de la vía.4 El Doctor Octopus aparece de nuevo, deja a Spider-Man inconsciente de un golpe y se lo lleva a Harry.2

Cuando se dispone a matar a Spider-Man, Harry descubre a Peter detrás de la máscara.4 Peter le convence de desvelar el paradero del Doctor Octopus y se encamina a su laboratorio con la intención de rescatar a Mary Jane. Uno de los tentáculos del Doctor Octopus descubre su presencia y luchan de nuevo. Spider-Man vence esta vez, y revela su identidad, suplicando al Doctor Octopus que deje de lado sus ambiciones por el bien común. Este cede y recupera el control de los tentáculos. Destruye el reactor sumergiéndolo en el río Hudson perdiendo la vida al mismo tiempo. Mary Jane descubre la identidad de Spider-Man. Peter le confiesa sus sentimientos y la deja con John.2 4

Mientras tanto, Harry, traumatizado por los sucesos que ha presenciado recibe la visita del fantasma de su padre, que se le aparece en un espejo y le pide vengar su muerte. Harry rehúsa y rompe el espejo, descubriendo una habitación secreta con el equipo del Duende Verde. En las escenas finales, Mary Jane huye de su boda para reunirse con Peter.2 Tras besarse, presencian una persecución policiaca y Mary Jane apremia a Peter a transformarse en Spider-Man y prestar ayuda.