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Un joven llamado Peter Parker es abandonado por sus padres, que lo dejan con sus tíos, Ben y May, y luego se marchan sin dar ninguna explicación.

Años después, un adolescente Peter asiste al Instituto de Ciencias Miltdown, donde es acosado por el matón Flash Thompson y se siente atraído por Gwen Stacy. Un día, Peter encuentra unos papeles de su padre, Richard Parker, y descubre que estuvo trabajando en Industrias Oscorp con el Dr. Curtis Connors, un científico con un brazo incompleto. Peter se cuela en Oscorp y se mete en una habitación donde es mordido por una araña manipulada genéticamente, adquiriendo las capacidades de una araña.

Después de estudiar los papeles de su padre, Peter visita a Connors. Connors en un principio le pide que se vaya, pero lo recibe bien al saber que es el hijo de Richard Parker. Connors explica que en su momento, él y Richard intentaron crear un suero que regenerara o curara cualquier parte del cuerpo humano. El objetivo de ambos era usar el suero para regenerar el brazo incompleto de Connors y ayudar a todas las personas con problemas físicos, pero la investigación se perdio por la misteriosa desaparición de Richard y su esposa Mary. Peter decide ayudar a Connors a completar la fabricación del suero. En el instituto, Peter usa sus poderes para humillar a Flash Thompson durante un partido de baloncesto, pero acaba destrozando una de las canastas. El tío Ben se ve obligado a marcharse del trabajo para reunirse con el director, por lo que tiene que trabajar hasta más tarde, así que le pide a Peter que recoja a la tía May a las nueve. Peter y Connors fabrican un suero con ADN de lagarto y se lo inyectan a un ratón con solo tres patas. El ratón recupera su cuarta pata, pero Peter se distrae y se olvida de recoger a la tía May. Por ello, Peter y el tío Ben tienen una discusión que termina con Peter yéndose enfurecido de casa. Peter trata de comprar una caja de leche, pero el encargado de la tienda se niega a dársela por unos centavos. Peter se enfada con el encargado, así que cuando un ladrón asalta la tienda, lo dejo escapar. El tío Ben (que había salido a la calle para encontrar a Peter) se cruza con el ladrón y trata de detenerlo, pero este le dispara. El ladrón escapa mientras Peter encuentra a su tío muerto en la acera.

Después de eso, Peter detiene a todos los ladrones que se parecen al asesino de su tío con la esperanza de encontrar al verdadero. En el proceso, Peter cae en un gimnasio donde ve el cartel de un luchador enmascarado. Inspirándose en ese cartel, Peter se hace una máscara a la que añade un supertraje y unos lanza telarañas que se puede colocar en ambas muñecas, convirtiéndose en el superhéroe Spider-Man. Gwen invita a Peter a cenar a su casa. En la cena, Peter conoce al padre de Gwen, el capitán de la policía George Stacy, que opina que Spider-Man no es más que un delincuente. Después de la cena, Peter le revela a Gwen que él es Spider-Man y los dos se besan.

El superior de Connors, el doctor Ratha, presiona a Connors para que pruebe el suero con humanos. Connors se niega, ya que sería arriesgarse demasiado, así que Ratha lo despide y decide inyectarles el suero a los ancianos del Hospital de Veteranos diciéndoles que es una vacuna contra la gripe. Desesperado, Connors se inyecta el suero en sí mismo y su brazo se cura, así que trata de alcanzar a Ratha antes de que llegue al Hospital de Veteranos, pero su piel empieza a volverse verde y escamosa y al llegar al Puente de Williamsburg, se convierte en una mezcla violenta entre un hombre y un lagarto. Connors (convertido ahora en el supervillano Lagarto) tira varios coches por el puente, entre ellos el de Ratha, pero Spider-Man llega y usa sus telarañas para salvar varios coches.

Spider-Man sospecha que Connors es Lagarto y se enfrenta a la criatura en las alcantarillas. Spider-Man pierde y huye, pero deja caer una cámara. Lagarto recoge la cámara y lee una etiqueta que dice ‘Propiedad de Peter Parker’, y de esa manera descubre la identidad de Spider-Man. Lagarto pelea con Peter en el instituto y en respuesta, la policía persigue tanto a Spider-Man como a Lagarto. La policía captura a Spider-Man, pero el capitán Stacy lo deja marchar después de saber que es Peter. Lagarto planea soltar desde la torre de Oscorp un gas que convierta a toda la cuidad en hombres-lagarto como él. En la pelea final, Lagarto le clava sus garras al capitán Stacy, pero Spider-Man logra soltar un gas que posee el antídoto del suero, por lo que Connors y todos lo que habían sido convertidos en hombres-lagarto vuelven a la normalidad. El capitán Stacy está herido de muerte, pero antes de morir le hace prometer a Peter que se alejará de Gwen para protegerla de los enemigos de Spider-Man. Peter se lo ‘promete’. Peter llega tarde a clase, pero le promete a la profesora que no volverá a pasar. La profesora le dice a Peter que no haga promesas que no pueda cumplir, pero Peter le responde en voz baja que las promesas que no se pueden cumplir son las mejores. Gwen oye eso y sonríe.

Connors es encarcelado. En la celda, un hombre aparece de entre las sombras y le pregunta a Connors si le dijo a Peter la verdad sobre su padre. Connors responde que no y le dice al hombre misterioso que debería dejar en paz a Peter. El hombre desaparece entre las sombras.